多能干細胞凍存和復蘇方法

干細胞凍存是干細胞擴增傳代過程中重要的一環，但是干細胞不同于普通細胞系，其增殖擴增過程中需要聚團生長，為保持其細胞活性，不建議單細胞傳代。而且使用血清+DMSO凍存方法，不能很好的保持細胞活性，且復蘇細胞成活率較低。這次就重點介紹干細胞進行凍存以及解凍的標準化步驟。

本方法適用于HAKATA? 人間充質干細胞無血清培養基以及HAKATA? 無血清細胞凍存液培養的細胞（同樣適用于mTesR以及E8系統培養的細胞），凍存以及復蘇前后，應當使用同一種培養基，復蘇傳代后可以更換其他培養體系。

HAKATA? 無血清細胞凍存液是一款化學成分確定，無血清，無動物源成分，且無需程序降溫的高效凍存液。具體凍存及復蘇操作方法如下：

1、凍存：以下操作方法以6孔板為例：

注意：如果使用mFreSR?，請將所需量的mFreSR?融化并置于冰上。

（1） HAKATA? 無血清細胞凍存液為即拿即用，且4℃保存，凍存液拿出后應快速放回4℃；

（2）使用干細胞消化液消化細胞；

（3）收集細胞，室溫300×g離心5分鐘；

（3）小心吸掉上清液，不要干擾細胞團；

（4）用1ml凍存液重懸細胞，并均勻分裝到凍存管中

采用非程序降溫法，將凍存管直接放入-80℃冰箱中，凍存24h后轉移至液氮中長期保存。

2、解凍

預先包被細胞培養板，人ES和iPS細胞解凍后應立即接種到培養板中。

（1）干細胞培養基室溫平衡15-30min,不能37℃加熱;

（2）在水浴鍋中持續晃動凍存管，37℃水浴鍋中快速解凍細胞，直至細胞完全融化；

（3）取出凍存管，用70％乙醇擦拭凍存管表面；

（4）準備15ml離心管，預先加入5mL干細胞培養基，將細胞懸浮液緩慢逐滴至15mL離心管中，盡量保持細胞聚團狀態。

（5）在室溫300×g離心5分鐘。

（6）吸掉上清，注意不要干擾細胞沉淀。使用1mL多能干細胞培養基輕輕地重懸細胞3-5次，不要破壞細胞聚團狀態。

（7）分別取0.5mL細胞懸液，均勻接種到包被好的6孔板的2個孔中，并分別補充多能干細胞培養基至2m。

（8）置于37°C細胞培養箱中。在前后左右呈十字形搖動培養板板5次，以均勻分散細胞。

（9）每天更換培養基，并顯微鏡下觀察細胞狀。